全基因合成、基因改造傻傻分不清楚?生技專家為您解密

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全基因合成、基因改造傻傻分不清楚?生技專家為您解密

這種基因合成方法基於Fok I 的獨特特性,可生成四個鹼基突出的末端,可用於寡核苷酸有序連接。簡而言之,首先將合成的寡核苷酸(單鏈基因片段)在線性化的變性質粒DNA中的兩個側翼Fok I位點之間退火。用退火的DNA 轉化大腸桿菌會導致體內缺口修復和插入片段的擴增(長至100 nt),這是一種被稱為橋誘變的技術(12 )。該重組質粒被消化霍I,釋放具有5'-突出的四個鹼基末端的雙鏈片段,其可用於與類似製備的其他基因片段的內聚末端連接。這種Fok I基因合成方法為從小片段構建更大尺寸的基因提供了模塊化方法的靈活性。



最初以自動基因合成技術的形式發表,也是一種基於循環的過程,儘管該過程避免了擴增並避免了髮夾寡核苷酸的粘性末端連接通常具有三基單鏈突出端的構建模塊,稱為splinker和anchors。該過程總共需要64個Splinker和4096個錨點。最初,
全基因合成將選定的splinker連接到選定的錨。連接產物通過錨中包含的生物素部分固定。洗滌除去任何未連接的鏈結物,然後用IIS型核酸內切酶消化所得固定化產物留下三個鹼基的單鏈突出端。然後丟棄固定的序列,因此除去消化的(和任何未連接的)錨。
 
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